不过，随着对基因组中更多 lncRNAs 功能分析的进行，编码微肽的 IncRNA 不断地被发现。例如，2014年2月，哈佛大学的研究人员在斑马鱼中发现了一个 lncRNA，其编码的微肽有58个氨基酸，它是斑马鱼胚胎早期发育相关的细胞移动所必需的一类信号蛋白。另一项研究在小鼠胚胎心脏和骨骼肌里发现了多个候选目标，其中有一个序列高度保守的 IncRNAs，在其序列保守区既有起始密码子又有终止密码子，能编码46个氨基酸。研究者称之为 myoregulin，它是参与调控肌肉紧张度的一个重要的钙泵调节器。

　　诸如此类多年来躲在雷达下的微肽就像金矿一样存在着，atv，等待我们积极地去挖掘。

　　寻找隐藏的小肽

　　研究者们开展了大量的 RNA 测序去识别 sORFs，直播，并用质谱寻找可能的肽段。但是这项技术每次只能分析少量的 sORFs。直到2009年，一种叫做核糖体图谱分析（ribosome profiling）的新方法被开发出来，结合核糖体相关 RNA 的深度测序技术，能够快速地在全基因组水平对不同大小的开放阅读框进行大规模分析。

　　这项技术是由核糖体足迹分析（ribosome footprints）方法发展而来，该方法是明确与蛋白质翻译机器相关的 RNA 的最直接的方法。在核糖体足迹分析中，研究人员首先将核糖体相关 RNA 分离出来，用核酸酶消化掉不被核糖体保护的 RNA，分离回收被核糖体保护的 RNA，然后对这部分 RNA 短片段测序并进行后续分析。由于非编码 RNA 有时也会与核糖体有关联，该方法仍需要质谱技术验证所得 RNA 产生的蛋白质在细胞中是否存在。

用于搜寻与蛋白质翻译有关的编码 RNA 的核糖体足迹分析方法。（图片来源：BRYAN SATALINO）

　　之前的核糖体足迹分析方法只能分析单个特定的转录翻译信息，无法用于检测细胞内发生的所有事件。当新一代测序技术出现之后，才得以一次性读取成百上千的“足迹”，由核糖体足迹分析技术改进成的核糖体图谱分析技术，能最大程度地获得整个转录组的翻译信息。

Ingolia 等人设计的核糖体图谱分析技术的主要步骤。图片来源：WIREs RNA

　　2011年，Ingolia 等人报道了小鼠胚胎干细胞基因组中，非编码区转录出的大多数 lncRNAs 实际上与核糖体有关联。这篇论文是一个里程碑，它证明了编码区以外也存在很多蛋白质翻译事件。

　　编码微肽的 sORFs 相关转录组的确存在。除此之外，他们还发现细胞核内某些有明确功能的 lncRNAs 也与核糖体有关联。例如，端粒酶 RNA 作为经典 lncRNA，其实是端粒 DNA 复制的模板；参与 RNA 剪接的小核 RNA，在核糖体图谱分析中显示出了高度的翻译特性。需要注意的是，占用核糖体（ribosome occupancy）的 RNA 并不表示就一定真正的翻译成蛋白质。

　　单从核糖体占用来看，并不足以区分转录本为编码 RNA 还是非编码 RNA。（图片来源：Cell）

　　与核糖体关联的某些 RNA 可能仅仅参与翻译调控，与核糖体也可能只是随机互作，这种互作关系甚至会产生微小的非功能肽，或因其不稳定而被迅速降解。为了辨别核糖体图谱分析得到的真正翻译事件，核糖体释放分数（ribosome release score）作为度量标准被提出来，该标准基于核糖体结合的 RNA 片段在全长 mRNA 分子上的分布状态。当核糖体沿着 ORF 翻译至终止密码子时，核糖体与转录本的关系也随之终止，它们会从 mRNA 上释放下来。翻译成蛋白质的 RNA 编码区相比下游非翻译区，应显示出更大比例的核糖体足迹片段，意味着终止密码子之后的 RNA 片段与核糖体的关联在核糖体图谱中会有显著下降，而对于经典的非编码 RNA 则不是这样。

核糖体释放分数简图。（图片来源：Guttman lab）